Active Tissue Plasminogen Activator (tPA) (APA525Mu01)

Активность связывания тканевого активатора плазминогена (tPA) с ингибитором активатора плазминогена 1 (PAI1). Активаторы плазминогена представляют собой сериновые протеазы, катализирующие активацию плазмина посредством протеолитического расщепления его зимогена - плазминогена. Плазмин является ключевым фактором фибринолиза - процесса деградации полимеров фибрина, образующихся при свертывании крови. Выделяют два основных активатора плазминогена: урокиназу (uPA) и тканевой активатор плазминогена (tPA). Препараты tPA применяют для лечения состояний, связанных с тромбообразованием, включая эмболический или тромботический инсульт, инфаркт миокарда и тромбоэмболию легочной артерии. Поскольку ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI1) идентифицирован как партнер взаимодействия tPA, был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного мышиного tPA и рекомбинантного мышиного PAI1. Кратко: tPA серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые PAI1, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к tPA, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее проводили инкубацию с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего раствор удаляли и выполняли трехкратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания tPA и PAI1 представлена на рисунке 1; наблюдаемый эффект носил дозозависимый характер.