Active Tubulin Beta (TUBb) (APB870Hu01)

Тубулин является основным структурным компонентом микротрубочек - цилиндрических образований, состоящих из латерально ассоциированных линейных протофиламентов, образованных гетеродимерами альфа- и бета-тубулина. Бета-тубулин (TUBb) представляет собой сферическую молекулу, состоящую из 455 аминокислот. Белок активации монооксигеназы тирозин-3/триптофан-5 дзета (YWHAz) обладает исключительно высоким сродством к TUBb, в связи с чем для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого TUBb и рекомбинантного человеческого YWHAz был проведен функциональный связывающий иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: TUBb последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые YWHAz, и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к TUBb, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч при 37°C, после чего лунки опорожняли и промывали пятикратно. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали 15–25 минут при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания рекомбинантного человеческого TUBb и рекомбинантного человеческого YWHAz представлена на Рисунке 1; значение EC50 для данного эффекта составило 0,88 мкг/мл.