Active Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFa) (APA133Hu01)

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), секретируемый преимущественно макрофагами, способен индуцировать гибель определенных линий опухолевых клеток. Сообщается, что TNF-α ингибирует пролиферацию и вызывает апоптоз клеток линии A549; кроме того, стимуляция данным фактором приводит к повышению концентрации интерлейкина-1 бета (IL-1β) и интерлейкина-8 (IL-8) в культуральном супернатанте. В связи с этим было проведено исследование стимуляции клеток A549 фактором TNF-α. Кратко: клетки A549 инкубировали в среде DMEM с различными концентрациями TNF-α (1, 10, 100 и 1000 нг/мл) в течение 8 часов, после чего концентрации IL-1β и IL-8 в супернатанте определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Уровни IL-1β и IL-8 в супернатанте клеток A549 достоверно повышались после стимуляции; соответствующие данные представлены на рисунках 1 и 2.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), также известный как кахектин и TNFSF2, секретируется преимущественно макрофагами и является прототипическим лигандом суперсемейства TNF. TNF-α играет важную роль в иммуномодуляции, развитии лихорадки, воспалительном ответе, ингибировании опухолеобразования и подавлении вирусной репликации. Сигналинг TNF-α осуществляется через два различных клеточных поверхностных рецептора: TNFR1 (TNFRSF1A, CD120a, p55) и TNFR2 (TNFRSF1B, CD120b, p75). Для оценки взаимодействия рекомбинантного человеческого TNF-α и рекомбинантного мышиного TNFRSF1B был проведен функциональный иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: TNF-α последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые TNFRSF1B, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к TNF-α, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее проводили инкубацию с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч при 37 °C, после чего раствор удаляли и выполняли пятикратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания рекомбинантного человеческого TNF-α с рекомбинантным мышиным TNFRSF1B представлена на рис. 1; значение EC50 для данного эффекта составило 0,11 мкг/мл.