Active Valosin Containing Protein (VCP) (APC601Hu01)

Белок VCP представляет собой АТФазу, ассоциированную с разнообразными клеточными процессами (AAA), которая играет ключевую роль в поддержании клеточного гомеостаза и экспрессируется повсеместно в тканях. На клеточном уровне VCP функционирует в различных компартментах: преимущественно локализуется в цитоплазме, тогда как меньшая фракция связывается с органеллами или находится в ядре, участвуя в различных сигнальных путях. VCP формирует гомогексамер, каждый мономер которого состоит из N-концевого домена, взаимодействующего с адаптерами и кофакторами; двух АТФазных доменов D1 и D2, которые за счет гидролиза АТФ обеспечивают формирование гексамера и поддерживают активность VCP соответственно; и C-концевого домена, связывающего ограниченный набор кофакторов и адаптеров, cooperating с активностью домена D2. Основная функция VCP заключается в распознавании и экстракции убиквитинированных белков из мембран, белковых комплексов, агрегатов или хроматина с последующей модуляцией их убиквитинирования или деубиквитинирования, а также усилением их деградации через убиквитин-протеасомную систему или аутофагический путь. Активность рекомбинантного человеческого VCP оценивали по способности гидролизовать субстрат АТФ до неорганического фосфата, который детектировали с помощью набора для определения фосфата на основе малахитового зеленого (Beyotime # S0196M). Реакцию проводили в буфере для анализа (20 мМ HEPES, 13 мМ NaCl и 1% глицерин, pH 8,5), инициируя добавлением 27 мкл различных концентраций VCP (разведенных в буфере для анализа) к смеси 3 мкл 100 мМ АТФ и 100 мМ MgCl2. В качестве отрицательного контроля использовали лунку без VCP, куда добавляли 27 мкл буфера для анализа. Инкубацию проводили при 37°C в течение 5 мин, после чего реакцию останавливали быстрым замораживанием образцов в смеси сухого льда и этанола. После оттаивания при комнатной температуре 4 мкл образца добавляли к 196 мкл буфера для анализа, затем вносили 70 мкл реагента для детекции фосфата и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Оптическую плотность измеряли при длине волны 630 нм. Удельная активность рекомбинантного человеческого VCP составляет >1000 пмоль/мин/мкг.