Caspase-8 Rabbit mAb (A28460)

Проведен анализ методом вестерн-блоттинга лизатов клеток RAW 264.7 с использованием моноклонального кроличьего антитела к каспазе-8 (A28460) в разведении 1:6000 (инкубация проводилась в течение ночи при 4 °C). Клетки RAW 264.7 предварительно обрабатывали циклогексимидом (CHX, 10 мкг/мл) в течение ночи при 37 °C, после чего инкубировали с фактором некроза опухоли альфа (TNF-α, 200 нг/мл) в течение 4 часов при 37 °C. В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антитела против IgG кролика (H+L) (AS014) в разведении 1:10000. Нагрузка белка составляла 30 мкг на лунку. Блокирование осуществляли с помощью 3% раствора обезжиренного сухого молока в буфере TBST. Детекцию проводили с использованием набора ECL Basic Kit (RM00020), время экспозиции — 20 с.

Иммунопреципитацию каспазы-8 из 300 мкг экстракта клеток RAW 264.7 проводили с использованием 1 мкг моноклонального кроличьего антитела к каспазе-8 (A28460). В качестве контроля для преципитации использовали кроличий контрольный IgG (AC005). Образцы после иммунопреципитации элюировали буфером Лэммли (1x). Дорожка «Input» соответствует 10% от общего количества исходного материала. Вестерн-блоттинг иммунопреципитатов выполняли с применением моноклонального кроличьего антитела к каспазе-8 (A28460) в разведении 1:10 000.

Проведено конфокальное микроскопирование клеток RAW 264.7, обработанных циклогексимидом (CHX) и фактором некроза опухоли альфа (TNF-α), а также необработанных клеток. Образцы окрашивали моноклональным кроличьим антителом к каспазе-8 (A28460, разведение 1:200), после чего инкубировали с козьими антителами против IgG кролика (H+L), конъюгированными с Cy3 (AS007, разведение 1:500) (красная флуоресценция). Ядра клеток контрастировали DAPI (синяя флуоресценция). Увеличение объектива: 100x.