Phospho-DRP1-S616 Rabbit mAb (AP1573)

Проведен анализ методом вестерн-блоттинга лизатов клеток PC-12 с использованием кроличьего моноклонального антитела к фосфорилированному DRP1 (Ser616) (AP1573) в разведении 1:1000. Инкубацию первичного антитела осуществляли при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Клетки PC-12 подвергали сывороточному голоданию в течение ночи, после чего стимулировали добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) при 37°C в течение 30 минут. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) козье антитело против IgG кролика (H+L) (AS014) в разведении 1:10000. На дорожку наносили 30 мкг общего белка. Блокирование неспецифического связывания проводили с использованием 3% обезжиренного сухого молока в буфере TBST. Детекцию сигналов выполняли с помощью набора ECL Basic Kit (RM00020), время экспозиции составило 90 секунд.

Проведен анализ методом вестерн-блоттинга различных клеточных лизатов с использованием кроличьего моноклонального антитела к фосфорилированному DRP1 (Ser616) (AP1573) в разведении 1:5000 при инкубации в течение ночи при 4°C. Клеточные линии HeLa и NIH/3T3 подвергали голоданию по сыворотке в течение ночи, после чего обрабатывали каликулином А (100 нМ) при 37°C в течение 30 минут. В качестве вторичных антител применяли козьи антитела против IgG кролика (H+L), конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (AS014), в разведении 1:10000. Нагрузка белка составляла 30 мкг на лунку. Блокирование проводили с использованием 3% обезжиренного сухого молока в буфере TBST. Детекцию осуществляли с помощью набора ECL Basic Kit (RM00020). Время экспозиции — 20 с.

Иммунопреципитацию фосфорилированного по остатку серина 616 белка DRP1 (Phospho-DRP1-S616) проводили из 600 мкг экстрактов клеток HeLa. Клетки подвергали голоданию по сыворотке в течение ночи, после чего обрабатывали калликулином А (100 нМ) при 37 °C в течение 30 минут. Для преципитации использовали 1 мкг моноклонального кроличьего антитела к Phospho-DRP1-S616 (AP1573). В качестве контроля использовали образец, полученный с применением контрольного кроличьего IgG (AC005). Образцы после иммунопреципитации элюировали буфером Лэммли (1×). Дорожка «Input» представляла 10% от общего количества исходного материала. Вестерн-блоттинг иммунопреципитатов выполняли с использованием моноклонального кроличьего антитела к Phospho-DRP1-S616 (AP1573) в разведении 1:5000.