Phospho-MEK1/MEK2-S217/S221 Rabbit mAb (AP1349)

Иммунопреципитацию фосфорилированных по остаткам Ser217/Ser221 белков MEK1/MEK2 проводили из 1000 мкг экстрактов клеток HeLa, обработанных форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA, 200 нМ, 1 ч), с использованием 2 мкг кроличьего моноклонального антитела к Phospho-MEK1/MEK2-S217/S221 (AP1349). В качестве контроля использовали кроличий изотипический IgG (AC042). Образцы после иммунопреципитации элюировали буфером Лэммли (1×). Дорожка «Input» представляла 10% от общего количества исходного материала. Вестерн-блоттинг иммунопреципитатов выполняли с применением кроличьего моноклонального антитела к Phospho-MEK1/MEK2-S217/S221 (AP1349) в разведении 1:5000.

Проведен анализ методом вестерн-блоттинга различных клеточных лизатов с использованием кроличьего моноклонального антитела к фосфорилированным формам MEK1/MEK2 (по остаткам Ser217/Ser221) (AP1349) в разведении 1:3000 (верхняя панель) или кроличьего моноклонального антитела к MEK1/MEK2 (A4868) в разведении 1:1000 (нижняя панель). Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°C. Клетки HeLa и NIH/3T3 подвергали голоданию по сыворотке в течение ночи, после чего обрабатывали форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA) в концентрации 100 нМ при 37°C в течение 30 минут. Клетки C6 также предварительно голодали по сыворотке в течение ночи, затем обрабатывали PMA в концентрации 200 нМ при 37°C в течение 30 минут. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) козье антитело против IgG кролика (H+L) (AS014) в разведении 1:10000. На дорожку наносили 30 мкг белка. Блокирование осуществляли с помощью 3% обезжиренного сухого молока в буфере TBST. Детекцию проводили с использованием набора ECL Basic Kit (RM00020). Время экспозиции составило 45 с.