Phospho-mTOR-S2448 Rabbit mAb (AP1413)

Проведен анализ методом вестерн-блоттинга лизатов клеток NIH/3T3 с использованием кроличьего моноклонального антитела к фосфорилированному mTOR (Ser2448) (AP1413) в разведении 1:1000. Клетки NIH/3T3 подвергали голоданию по сыворотке в течение ночи, после чего обрабатывали эпидермальным фактором роста (EGF) в концентрации 100 нг/мл при 37°C в течение 30 минут. В качестве вторичных антител применяли козьи антитела против IgG кролика (H+L), конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (AS014), в разведении 1:10000. На дорожку наносили 25 мкг белка. Блокирование осуществляли с использованием 3% обезжиренного сухого молока в буфере TBST. Детекцию проводили с помощью набора ECL Enhanced Kit (RM00021), время экспозиции составило 120 с.

Проведено конфокальное микроскопирование необработанных клеток HeLa и клеток HeLa, обработанных рапамицином. Образцы окрашивали моноклональным кроличьим антителом к фосфо-mTOR (Ser2448) (AP1413, разведение 1:300) с последующей инкубацией с конъюгированным с Cy3 козьим антителом против IgG кролика (H+L) (AS007, разведение 1:500) (красный сигнал). Для контрастного окрашивания использовали моноклональное мышиное антитело к α-тубулину (AC012, разведение 1:400) с последующей инкубацией с конъюгированным с ABflo® 488 козьим антителом против IgG мыши (H+L) (AS076, разведение 1:500) (зеленый сигнал). Ядра клеток окрашивали DAPI (синий сигнал). Увеличение объектива: 100x.

Проведен анализ методом вестерн-блоттинга лизатов клеток линии C6 с использованием кроличьего моноклонального антитела к фосфорилированному mTOR (Ser2448) (AP1413) в разведении 1:1000. Инкубацию с первичным антителом осуществляли в течение ночи при температуре 4°C. Клетки C6 предварительно подвергали голоданию по сыворотке в течение ночи, после чего обрабатывали форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA) в концентрации 100 нМ при 37°C в течение 30 минут. В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) козье антитело против IgG кролика (H+L) (AS014) в разведении 1:10 000. На дорожку наносили 30 мкг общего белка. Блокирование неспецифического связывания проводили с использованием 3% обезжиренного сухого молока в буфере TBST. Детекцию сигналов выполняли с помощью набора ECL Basic Kit (RM00020), время экспозиции составило 10 секунд.