Recombinant Antibody to Green Fluorescent Protein (GFP) (RAD025Ge71)

Кратко: биотинилированное GFP-наноантитело последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые GFP, и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Лунки промывали три раза буфером PBST и инкубировали в течение 0,5 ч при 37°C с пероксидазой хрена (HRP), конъюгированной со стрептавидином (SA). После инкубации с SA-HRP содержимое лунок удаляли аспирацией и проводили пятикратную промывку. Добавляли субстратный раствор и инкубировали лунки в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания между GFP и GFP-наноантителом представлена на рисунке 1; значение ED50 для данного эффекта составило 0,0187 мкг/мл.

GFP иммунопреципитировали из тотального клеточного лизата клеток 293F (экспрессирующих GFP) с использованием 2 мкг антител RAD025Ge71 и 20 мкл магнитных шариков на основе никеля. Иммунопреципитат анализировали методом вестерн-блоттинга с применением антител MAD025Ge21 (0,05 мкг/мл) и SAA544Mu19 (0,2 мкг/мл). Дорожка 1 (входной контроль): тотальный клеточный лизат 293F; дорожка 2: иммунопреципитация с антителами RAD025Ge71 в лизате 293F; дорожка 3 (отрицательный контроль): лизат 293F без добавления антител.