Active Acid Phosphatase 6, Lysophosphatidic (ACP6) (APD088Hu01)

Лизофосфатидная кислота фосфатаза типа 6 (ACP6) представляет собой мономерный белок семейства гистидиновых кислотных фосфатаз с молекулярной массой 44–47 кДа. ACP6 высоко экспрессируется в почках, сердце, тонком кишечнике, мышцах, печени, предстательной железе, яичках и яичниках; существует в виде двух изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Фермент участвует в регуляции липидного обмена, гидролизуя лизофосфатидную кислоту (LPA) до моноацилглицерола (MAG) и фосфата. Аннексин V (ANXA5) связывается с фосфолипидными бислоями, образуя двумерные кристаллы, которые блокируют доступность фосфолипидов для реакций ферментов свертывания крови. Для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого ACP6 и рекомбинантного мышиного ANXA5 был проведен функциональный иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: ACP6 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые ANXA5, и инкубировали в течение 1 ч при 37°C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к ACP6, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее лунки инкубировали в течение 1 ч при 37°C с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего раствор удаляли и проводили пятикратную промывку. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания рекомбинантного человеческого ACP6 и рекомбинантного мышиного ANXA5 представлена на рисунке 1; значение EC50 для данного эффекта составляет 0,08 мкг/мл.